Odrzucanie aloprzeszczepu szpiku kostnego przez limfocyty T Rozpoznawanie różnicy pojedynczych aminokwasów w HLA-B44 ad

Przed przeszczepieniem pacjent poddano cytoredukcji frakcjonowanym napromienianiem całego ciała (1500 cGy) i cyklofosfamidem (40 mg na kilogram masy ciała dziennie przez cztery dni). Genotypem HLA pacjenta były HLA-A3, B7, DR2 / HLA-A2, B44, DR7. Znany był jedynie fenotyp dawcy HLA. Szpik był pozbawiony komórek T za pomocą aglutyniny soi i erytrocytów owcy19. Po transplantacji pacjent otrzymał metyloprednizolon (2 mg na kilogram na dzień) i globulinę antyitocytową (Atgam, Upjohn; 10 mg na kilogram dziennie co drugi dzień od dnia 5 do dzień 19). Trzynaście dni po transplantacji liczba białych krwinek wzrosła z 0,0 do 0,9 na metr sześcienny. Liczba różnicowa ujawniła 98 procent limfocytów. Limfocytoza ustąpiła w 15 dniu, ale utrzymywała się pancytopenia i aplazja szpiku. Krążące limfocyty były głównie komórkami T CD3 +, CD8 + i CD57- pochodzącymi od biorcy. Pacjent zmarł z powodu niewydolności wielonarządowej 68 dni po transplantacji. Metody
Analiza biochemiczna podtypów HLA przez IEF
IEF przeprowadzono zgodnie ze standardową metodą opracowaną na 10. Międzynarodowych Histokompatybilności. Warianty podtypów IEF HLA klasy I do komórek testowych zostały wykonane poprzez porównanie z wzorcami pasm uzyskanymi dla odpowiednich komórek referencyjnych.18
Test bezpośredniej cytotoksyczności
Jednojądrzaste komórki krwi obwodowej otrzymano od pacjenta podczas odrzucania przeszczepionego szpiku kostnego 13 do 15 dni po transplantacji. Komórki zostały użyte bezpośrednio w teście cytotoksyczności lub poddane kriokonserwacji w ciekłym azocie do późniejszego użycia. Testy cytotoksyczności przeprowadzono dla komórek jednojądrzastych krwi obwodowej jako komórek efektorowych w standardowym teście uwalniania 51Cr.21
Panel linii komórek B-limfoblastoidalnych typu HLA z panelu komórek odniesienia zaprojektowanych dla 10. Międzynarodowego Laboratorium Histokompatybilności został wybrany do scharakteryzowania allospecyficzności cytotoksycznych limfocytów T.22, 23
Budowa częściowej biblioteki genomowego DNA EcoRI
W celu skonstruowania częściowej biblioteki genomowego DNA, 450 .g genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej ekstrahowano z limfoblastoidalnej linii komórkowej B zwanej PITOUT (HLA-A29.2, B44.1) i trawiono do końca za pomocą endonukleazy restrykcyjnej. EcoRI (BMB, Indianapolis) w 37 ° C przez noc. Fragmenty DNA w zakresie od 5 do 9 kilobaz ligowano w ramiona wektora .Gt10 (Promega, Madison, Wis.) I pakowano do faga (Stratagene, La Jolla, CA).
Izolacja klonów swoistych dla HLA-B i sekwencjonowania DNA
W celu izolacji klonów swoistych dla HLA-B, 6 x 105 jednostek tworzących łysinki badano sondą DNA swoistą dla genu 5 HLA-B, p58.5.24. Dwa pozytywne klony, SKPB1 i SKPB2, zostały wybrane i zhybrydyzowane do 3 Sonda DNA swoista dla HLA-B pHLA1.125 w analizie dot-blot. Klon SKPB1 został wybrany do dalszego oczyszczenia i analizy sekwencji nukleotydów z użyciem metody terminacji łańcucha dideoksy Sanger i wsp.26 Zastosowano specyficzne dla eksonów startery oligonukleotydowe, jak opisano uprzednio27, w celu otrzymania pełnej sekwencji dla regionów kodujących HLA. -B gen.
Pisanie oligonukleotydem
Genomowy DNA ekstrahowano z czterech B-limfoblastoidalnych linii komórkowych homozygotycznych pod względem HLA-B44.1 (PITOUT, HOR, MOU i PF97387) i czterech takich linii komórkowych homozygotycznych pod względem HLA-B44.2 (AWELLS, EK, SP0010 i WT47)
[przypisy: gumtree pomorskie, szpital grucy otwock, angiogeneza ]