Odrzucanie aloprzeszczepu szpiku kostnego przez limfocyty T Rozpoznawanie różnicy pojedynczych aminokwasów w HLA-B44 cd

To DNA zostało użyte jako cel do amplifikacji trzech segmentów genów HLA-B przez reakcję łańcuchową polimerazy. [28] Amplifikowane segmenty odpowiadają parom zasad 118 do 272 egzonu 2, parom zasad 115-280 egzonu 3 i podstawie pary 14 do 255 egzonu 4. Warunki reakcji były następujące: zastosowano 150 ng docelowego DNA i 100 pmoli każdego startera i przeprowadzono 30 cykli amplifikacji, przy czym każdy cykl składał się z dwóch minut denaturacji w 94 ° C , dwie minuty wyżarzania w 62 ° C i trzy minuty wydłużania w 72 ° C. Hybrydyzacje kropek uzyskanych produktów przeprowadzono zgodnie ze standardową metodą.29 Sondy oligonukleotydowe stosowane do hybrydyzacji miały sekwencję identyczną z HLA-B * 440130, 31 lub HLA-B * 440230, 32 w pozycjach 242 do 244 egzonu 2, pozycje 197 do 199 egzonu 3 i pozycję 49 lub 66 eksonu 4. Sondy znakowano końcowo .- [32P] ATP. Generacja i identyfikacja limfoblastoidalnej linii komórkowej transfekowanej HLA-B44.1
Przeprowadzono transfekcję 107 komórek z limfoblastoidalnej linii komórkowej B zwanej CIR z 10 .g linearyzowanego klonu genomowego HLA-B44.1 SKPB1 i .g plazmidowego DNA plazmidu pSV2-neo (American Type Culture Collection 37149) z genem oporności na neomycynę. przez elektroporację33. Impuls elektryczny o wartości 0,25 kV przy pojemności 960 .F był podawany do komórek w 0,8 ml zwykłej pożywki do hodowli tkankowej RPMI 1640. Zastosowano kuwety genów i elektroporacji (długość ścieżki 0,4 cm, Bio-Rad, Richmond, CA). Selektywny wzrost linii komórek CIR transfekowanych genem HLA-B44.1 (zwany SKB44.1) przeprowadzono w kompletnej pożywce RPMI 1640 zawierającej 800 .g G418 na mililitr (GIBCO, Grand Island, NY). Komórki wyrażające HLA-B zidentyfikowano za pomocą analizy immunofluorescencyjnej, a następnie wzbogacono przez selekcję pozytywną za pomocą kulek magnetycznych pokrytych przeciwciałem monoklonalnym TU 109 (anty-HLA-Bw4).
Wyniki
Figura 1. Figura 1. Jednopłaszczyznowa analiza IEF dla antygenów HLA Klasy I otrzymanych z komórek jednojądrzastych z transformowanych fitohemaglutyniną komórek krwi obwodowej. Antygeny HLA znakowano metabolicznie znakowaną 35S metioniną i izolowano przez immunoprecypitację monoklonalnym przeciwciałem W6 / 32 (klasa anty-HLA I), jak opisano w Methods. Pas znacznikowy zawiera antygeny wzorcowe klasy I HLA.18
Figura 2. Figura 2. Test cytotoksyczności in vitro z komórkami jednojądrzastymi z krwi obwodowej otrzymanymi od pacjenta 13 do 15 dni po transplantacji. Cytotoksyczność mierzono jako czterogodzinne uwalnianie 51Cr przez transformowane fitohemaglutyniną jednojądrzaste komórki krwi obwodowej pacjenta (gospodarza) i dawcy szpiku. Znakowane 51Cr komórki docelowe B były stymulowanymi fitohemaglutyniną jednojądrzastymi komórkami krwi obwodowej od dawcy (.) i gospodarza (- – . – -). HLA-B44.1 było wyrażane przez limfoblastoidalne linie komórkowe PF97387 (+), PITOUT (.), MOU (.) i HOR (.); HLA-B44.2 według EK (… . …) i SP0010 (.); i homozygotyczność pod względem HLA-DR7 i DR2 przez LBUF (.) i SCHU (.).
Analiza cząsteczek HLA-B44 od pacjenta i dawcy przez IEF wykazała, że dawcy nosili podstawowy podtyp IEF B44.1, podczas gdy pacjent wyrażał bardziej kwaśny podtyp HLA-B44.2 (ryc.
[podobne: angiogeneza, tetniak aorty, drut kirschnera ]